如何监测肿瘤复发？术后的ctDNA-MRD检测

MRD（Minimal Residual Disease），即微小残留病灶，是指癌症治疗后残留在体内的少量癌细胞（对治疗无反应或耐药的癌细胞）。残留的癌细胞数量可能很少，不会引起任何体征或症状（但它们有可能导致癌症复发），甚至无法通过传统方法检测到，例如在显微镜下观察细胞和/或追踪血液中的异常血清蛋白标志物（肿瘤标志物）；

MRD是一种生物标志物，阳性结果意味着癌症治疗后仍可检测到残留（剩余）病灶（发现癌细胞，癌症治疗后残留的癌细胞会变得活跃并开始繁殖，导致疾病复发），阴性结果表示癌症治疗后未检测到残留（剩余）病灶（未发现癌细胞，对血癌患者来说是好事，研究表明MRD阴性与某些血癌更长的缓解期和更长的生存率有关）；

(资料图片)

医生可使用MRD来衡量治疗的有效性，并预测哪些患者有复发的风险：

可帮助医生动态监测和确认疾病的缓解情况，早期发现复发迹象，并尽早开始治疗；

可告诉医生初始治疗效果如何，如果标准治疗方案效果不佳，医生会更改治疗方案，以更有效地获得疾病缓解；

基于ctDNA指导的MRD（微小/可测量残留病灶或分子残留病灶）评估，可优于传统的临床或影像学方法鉴定出有MRD的患者，并在预测疾病复发风险等方面具有较高的灵敏度和特异性。

同时，手术创伤可导致细胞的死亡增加，与血液cfDNA的水平增加有关。

ctDNA仅占癌症患者体内cfDNA的一小部分，手术创伤诱导的野生型cfDNA释放到血液循环中会使ctDNA的检测变得复杂化。

从技术上讲，野生型cfDNA的激增对任何用于ctDNA检测的方法的技术灵敏度和特异性的要求也增加了。

因此，了解ctDNA检测环境中野生型cfDNA的波动至关重要，并应注意避免cfDNA的水平升高。

癌症手术创伤引起的cfDNA浓度增加对ctDNA有何影响？

1）cfDNA的半衰期约为2小时，尽管如此，手术创伤后的cfDNA浓度可能会持续数天甚至数周的升高，恢复到创伤前cfDNA水平的时间因创伤严重程度而异。

那么，手术后cfDNA水平是否一定会升高？如果升高一般多久会恢复到正常cfDNA水平？手术后何时采血进行ctDNA检测才更准确？

2）cfDNA主要是通过细胞凋亡释放，产生短的约为166bp大小的核小体DNA片段（又称普通cfDNA）。

那么，手术创伤诱导的cfDNA是否具有类似的片段化大小？

如果手术创伤诱导的cfDNA片段化程度较低（或更长），是否可以根据其片段大小将其与普通cfDNA（标准核小体cfDNA）分离，以避免创伤诱导的cfDNA对ctDNA检测的影响？

3）创伤诱导的cfDNA是否会影响ctDNA-MRD的检测？

这些问题，在《Molecular Oncology》发表的一篇文章中，给出了解释。

研究人员对436名结直肠癌（CRC）患者和47名肌层浸润性膀胱癌（MIBC）患者在手术前和手术后6周内收集配对血浆样本中的cfDNA水平进行了定量。

样本采集：术前和术后采用10ml规格EDTA管进行全血采集，并于2h内两次离心处理，将分离出的血浆置于-80℃保存。

cfDNA分离和定量：从8ml血浆样本中纯化cfDNA。CRC患者血浆样本中的cfDNA拷贝数通过ddPCR进行测定，该测定方法特异性针对Chr3和Chr7上的两个高度保守区域；MIBC患者血浆样本中的cfDNA通过Quant-iT高灵敏度dsDNA检测试剂盒（Quant-iT High-Sensitivity dsDNA Assay Kit）进行定量。

cfDNA大小描述：使用SPRI磁珠进行cfDNA的短片段（

1kb）双面选择，分离的cfDNA大小在LabChip GX上进行分析，并使用Quant-iT高灵敏度dsDNA检测试剂盒进行定量。

ctDNA测量：从这些患者中选择影像学证实复发的患者（n=25），对cfDNA掩盖的ctDNA进行分析，这些患者在手术后立即检测ctDNA-MRD为阴性，并在第6个月前变为ctDNA-MRD阳性（n=8）。

cfDNA统计分析：将每位患者的术后cfDNA浓度标准化为术前cfDNA浓度。根据采血日期，术后数据以1周为间隔进行分组分析。

主要研究成果

1. 手术创伤后cfDNA水平会升高，并在第4周后恢复至创伤前水平。

CRC患者术后cfDNA平均水平比术前高出3倍，MIBC患者术后的cfDNA平均水平则高出8倍（这可能表明与结肠或直肠切除术相比，膀胱切除术与更严重的创伤有关）。两个患者队列的cfDNA水平在术后持续升高时间长达4周（P=0.0005且P≤ 0.0001）。

为了研究cfDNA增加的持续时间，将两个患者队列的术后cfDNA水平绘制为时间函数，CRC患者手术创伤后第1周cfDNA增加最多（中位增加3.6倍），并在接下来的3周内逐渐下降，然后在第五周恢复到创伤前水平。MIBC患者手术创伤后第1周cfDNA中位增加7.7倍，并在第2-3周达到最高水平，中位增加11.6倍，此后cfDNA逐渐下降，然后在第5~6周恢复到创伤前水平。

此外，术后cfDNA增加的发生与性别、年龄、UICC分期和肿瘤位置无关。

▲ 手术后cfDNA浓度的变化

▲ cfDNA浓度相对于术前水平的术后变化

手术创伤导致cfDNA水平升高长达4周。

因此，在术后采血进行ctDNA-MRD检测时，应仔细考虑采血时间，因为后期采样大大减少了因手术创伤引起的野生型cfDNA污染的问题。

如果延迟采血进行ctDNA检测不阻碍术后辅助治疗决定的话，该策略是可行且有益的。

2. 手术创伤诱导的cfDNA片段大小约为166bp，与普通cfDNA大小一致

为了评估手术创伤诱导的cfDNA片段是否比普通cfDNA片段长，对91名CRC患者确定了cfDNA短片段（

1kb）的大小和浓度，发现短片段cfDNA峰值大小约为166bp，与普通cfDNA（标准核小体cfDNA）大小一致。短片段cfDNA水平在第一周增加至中位数8.2倍，并在第2周逐渐下降，在第4（1.4倍）和第5周（1.1倍）达到术前水平。

相比之下，长片段cfDNA的水平几乎没有变化。

▲ 不同血浆样本短和长片段cfDNA大小分布情况

▲ cfDNA短片段和长片段的术后变化

术后cfDNA的增加是由与普通cfNDA或ctDNA大小相似的短片段cfDNA引起的，去除长片段cfDNA不太可能减轻由手术创伤诱导的cfDNA带来的问题。

普通cfDNA和手术创伤诱导的cfDNA之间的大小相似，表明了cfDNA有一个共同的断裂机制，最有可能是细胞凋亡。

3. 创伤诱导的cfDNA影响ctDNA的检测，建议ctDNA-VAF LoD低于0.012%。

随着手术创伤引起的cfDNA水平的增加，对任何用于ctDNA检测的方法的技术灵敏度和特异性的要求也增加了。ctDNA检测的可能性随特定技术的ctDNA-VAF LoD而异。

ctDNA检测的LoD越低，检出的可能性越高，并且随着术后cfDNA水平的逐渐下降，检出的可能性也越高。

如果想要实现检出>90%的样本，ctDNA-VAF LoD必须低于0.012%，无论其采样时间如何。

▲ cfDNA水平升高的样本中的ctDNA检测

由于只有少数ctDNA检测技术拥有0.01%或更低的VAF检测灵敏度。

因此，在ctDNA检测环境中避免来自手术创伤引起的野生型cfDNA污染将是理想的选择。

4. 纵向分析显示，cfDNA水平升高会阻碍ctDNA-MRD检测

共有25名患者在随访期间经影像学证实复发，因此是ctDNA-MRD阳性的候选者。

在手术创伤诱导的cfDNA期间，8名ctDNA-MRD阳性，17名ctDNA-MRD阴性（其中6名第4周后没有采集血液样本被排除掉，其中3名手术后ctDNA绝对水平太低被排除掉，剩余8名ctDNA-MRD阴性患者可分析）。

纵向样本分析显示，手术创伤诱导的cfDNA释放停止后不久，5名ctDNA-MRD阴性患者变为阳性（在6个月前，8名ctDNA-MRD阴性患者全部变为ctDNA-MRD阳性）。

手术创伤引起的cfDNA增加可能阻碍了ctDNA-MRD的检测。

▲ 5名患者的cfDNA浓度和绝对ctDNA VAF随时间变化情况

手术后立即采血的ctDNA水平很可能太低（ctDNA绝对水平不足，此时肿瘤负荷最低），无论cfDNA浓度如何，任何ctDNA检测技术都无法检测到。

将术后血液样本的采集推迟到第5周或更晚，届时cfDNA水平有望恢复正常，将降低手术创伤诱导的野生型cfDNA稀释ctDNA的可能性，ctDNA-MRD检测将会更准。

临床上操作时，考虑到辅助治疗的紧迫性，可以选择尽早抽取血液样本，例如在手术后第2周，然后在手术后5周再次抽取血液样本。如果可以在早期血样中检测到ctDNA-MRD阳性，则可以更快地启动辅助治疗。

如果没有，后面的血液样本可以为ctDNA-MRD阴性患者的再次检测提供更好的机会，因为此时的ctDNA-VAF会更高。

总之，手术创伤与cfDNA水平升高有关，持续长达4周，这可能掩盖了复发患者的ctDNA。手术创伤诱导的cfDNA与普通cfDNA的大小相似。为了减轻手术创伤引起的cfDNA对ctDNA检测的影响，建议在第4周后对最初ctDNA阴性的患者进行第二次血液样本分析。

参考资料： 

1.Lam NYL, Rainer TH, Chan LYS, Joynt GMand Lo YMD (2003) Time course of early and late changes in plasma DNA in trauma patients. Clin Chem 49, 1286–1291.

2.Jahr S, Hentze H, Englisch S, Hardt D, Fackelmayer FO, Hesch RD and Knippers R(2001) DNA fragments in the blood plasma of cancer patients: quantitations and evidence for their origin from apoptotic and necrotic cells. Cancer Res 61, 1659–1665.

3.Henriksen TV, Reinert T, Christensen E, Sethi H, Birkenkamp-Demtröder K, Gögenur M, Gögenur I, Zimmermann BG; IMPROVE Study Group, Dyrskjøt L, Andersen CL. The effect of surgical trauma on circulating free DNA levels in cancer patients-implications for studies of circulating tumor DNA. Mol Oncol. 2020 Aug;14(8):1670-1679.

文章来源：基因Talks、医世象，内容略有调整。

本文由医世象 夏日整编，转载联系授权。

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